در حالت طبيعي و يا در غياب پديده هوک، منحني استاندارد صعودي است اما چنانچه پديده هوک بوجود آيد با افزايش غلظت آناليت، منحني بجاي افزايش، کاهش يافته شکل قلاب يا هوک بوجود مي آيد. اولين گزارش اين پديده در سال 1974 توسط Miles و همکارانش مطرح شد. روش آنها IRMA و آناليت مربوطه فريتين بود. گزارش بعدي در اين زمينه به سال 1978 به آقاي Rodbard و همکارانش مربوط مي شود. از آنجايي که در هر دو گزارش کاهش کاذب در غلظت بالاي آناليت وجود داشت آن را پديده هوک در غلظت بالا نام نهادند. در هر دو روش براي نشاندار سازي از يد راديواکتيو و از روش ساندويچي يا دو جايگاهي استفاده شده بود. همانطور که مي دانيد سنجش هاي ايمني با استفاده از دو آنتي بادي به دو شيوه اجرا مي شوند:
1) تک مرحله اي
2) دو مرحله اي
در سنجش هاي ايمني دو جايگاهي تک مرحله اي، آنتي بادي اول- آناليت و آنتي بادي دوم همزمان در يک مرحله به ظرف واکنش افزوده مي شوند؛ سپس يک مرحله شستشو براي جداسازي آنتي بادي هاي نشاندار مازاد انجام مي شود. اما در روش هاي دو مرحله اي ابتدا آنتي بادي اول و آناليت به محيط افزوده شده، پس از انکوباسيون و شستشو، آنتي بادي نشاندار دوم به محيط افزوده مي شود. پس از انکوباسيون و شستشوي دوم آنتي بادي هاي نشاندار مازاد از محيط خارج مي شوند. در اين مرحله مي توان نتيجه واکنش مذکور را مورد خوانش (Reading) قرار داد.
| نوع سنجش | مقدار گزارش شده ناشي از پديده هوک | مقدار واقعي | آناليت |
| دو جايگاهي- تک مرحله اي | µg/L 200 | µg/L 33000 | PSA |
| دو جايگاهي- تک مرحله اي | IU/L 600 | IU/L 2500000 | hCG |
| دو جايگاهي- تک مرحله اي | IU/L 375 | KU/L 3520 | CA-125 |
لازم به ذکر است که ميزان واقعي آناليت پس از چندين مرحله رقيق سازي و سنجش مجدد بدست آمده است.
در سنجش هاي ايمني دو جايگاهي- تک مرحله اي (One step site Immunoassay) ميزان مازادي از آنتي بادي اول و دوم وجود دارد. آناليت بين دو آنتي بادي به حالت ساندويچي در مي آيد. در اين روش هر قدر ميزان آناليت افزايش مي يابد ميزان کمپلکس ساندويچي نيز زياد مي شود. از آنجايي که يکي از اين آنتي بادي ها نشاندار است در اصل با افزايش آناليت، ميزان کمپلکس سيگنال دهنده افزايش مي يابد و يک منحني صعودي براي نقاط استاندارد حاصل مي گردد. نکته اساسي اين است که همواره بايد غلظت هر کدام از آنتي بادي ها از ميزان آناليت بيشتر باشد يا به عبارتي ميزان آناليت در حالت فيزيولوژيک يا پاتولوژيک از ميزان هر کدام از آنتي بادي ها کمتر باشد. چنانچه اين اصل رعايت نگردد و ميزان آناليت مثلاً از آنتي بادي اول بيشتر باشد، ابتدا هر کدام از اين آنتي بادي ها به يک آناليت متصل شده، آناليت هاي مازاد به آنتي بادي دوم متصل مي گردند. حال دو نوع آنتي بادي دوم نشاندار وجود دارد. آنتي بادي دوم آزاد که مي تواند به آنتي بادي اول متصل به آناليت وصل شده و کمپلکس ايمني را تکميل کند و آنتي بادي هاي دومي که به مازاد آناليت متصل هستند و بديهي است که نمي توانند به آنتي بادي هاي اول آناليت دار متصل شوند لذا در مرحله شستشو از محيط خارج مي شوند. با توجه به اين موضوع، بايد کمپلکس ساندويچي تشکيل مي شد در حاليکه به صورت کمپلکس دو تايي حذف شده، لذا اندازه گيري آناليت با غلظت بالا دچار پاسخ هاي منفي کاذب شده است. محققي به نام Ryall و همکارانش با مدل IRMA دو جايگاهي پديده هوک را مشابه سازي و مطالعه نمودند. آنها علت پديده هوک را بدين صورت شرح داده اند : اين پديده به ميزان آناليت تثبيت شده بر روي آنتي بادي اول و کمپلکس ساندويچي آنتي بادي دوم مربوط است. ناکافي بودن آنتي بادي دوم نشاندار براي تشکيل کمپلکس سه تايي علت اصلي اين پديده است. پس از اين مرحله، محققان به کمک آناليت هاي مصنوعي دامنه تحقيقات را گسترش دادند و به اين نتيجه رسيدند که پديده هوک علاوه بر سنجش هاي ايمني دو جايگاهي تک مرحله اي در سنجش هاي دو مرحله اي نيز بوجود مي آيد. در اين بخش ها آنتي بادي اول بسيار ويژه عمل ميکند لذا نمونه مجهول به ظرف واکنش حاوي اين آنتي بادي افزوده مي شود. پس از واکنش ويژه ميان آنتي بادي و آناليت، ساير مولکولهاي مشابه و مزاحم با شستشو خارج مي شوند. حال آنتي بادي دوم نشاندار که از ويژگي زيادي برخوردار نيست به محيط افزوده مي شود تا کمپلکس ساندويچي نشاندار تکميل گردد. مثلاً در سنجش hCG، آنتي بادي اول، کاملاً اختصاص به زنجيره بتاي اين هورمون گليکوپروتئيني دارد اما آنتي بادي دوم نشاندار بر عليه زنجيره آلفا که بين هورمون هاي hCG، TSH، LH و FSH مشترک است عمل مي کند. لذا اگر آنتي بادي ها به صورت يک مرحله اي افزوده مي شدند آنتي بادي دوم مي توانست با مولکولهاي مشابه اشباع گردد اما با يک مرحله شستشو در مرحله دوم مولکولهاي مزاحم حذف شده، احتمال واکنش آنها با آنتي بادي دوم نشاندار وجود نخواهد داشت. اما در همين سنجش دو مرحله اي چنانچه غلظت آناليت از آنتي بادي اول بيشتر باشد قطعاً کليه آنتي بادي ها به آناليت متصل شده، تعدادي آناليت آزاد و سرگردان باقي مي ماند که با شستشو از محيط خارج مي شود و بدين ترتيب نمي تواند در مرحله دوم کمپلکس نشاندار بسازد. لذا تعداد کمپلکس هاي سيگنال دهنده از تعداد آناليت کمتر خواهد بود و به بيان ديگر پاسخ هاي منفي کاذب در غلظت بالاي آناليت و يا پديده هوک بوجود مي آيد. پس در روش هاي ساندويچي که روش هاي معرف مازاد (Excess Reagent) هستند در هر دو شيوه يک مرحله اي و دو مرحله اي امکان پديده هوک يا پاسخ منفي کاذب در غلظت بالاي آناليت وجود دارد. Fernando و Wilson بر خلاف تصور ساير محققان اثبات نمودند که در روش هاي معرف محدود (Restricted reagent) نيز پديده هوک مي تواند ايجاد شود. يادآوري مي گردد که روش هاي معرف محدود روش هاي رقابتي با منحني، نزولي هستند؛ مثلاً در سنجش تيروکسين ميزان آنتي بادي نبايد مازاد باشد بلکه براي ايجاد رقابت حتماً بايد ميزان آنتي بادي محدود باشد و چون اساس، رقابت است منحني نزولي ميگردد. محققان پديده مذکور در اين روش را ، پديده هوک در غلظت پايين (Low dose Hook effect) ناميده اند.ماهيت پديده هوک در روش هاي معرف محدود را برهم کنش هاي تعاوني (Co-Operative interaction) ذکر کرده اند. مثلاً در سنجش معرف محدود (رقابتي) هورمون رشد، ابتدا بين هورمون رشد آزاد و هورمون رشد راديواکتيو بر سر اتصال به ميزان محدودي آنتي بادي رقابت صورت مي گيرد اما در غلظت هاي بسيار بالاي اين هورمون، تشکيل تجمعات خطي يا حلقوي (Linear or circular aggregate) با واسطه چند آنتي بادي سبب کاهش کاذب ميزان آناليت يا پديده هوک مي گردد. پديده هوک در غلظت بالا و پديده هوک در غلظت پايين در سنجش هاي يک مرحله اي يا دو مرحله اي ارتباطب به نوع ماده نشاندار ندارد. لذا هرچند که اولين گزارشات اين پديده به روش هاي RIA و IRMA مربوط مي باشد اما در سنجش هاي آنزيمي، فلورسان و ... نيز با مکانيزم هاي ذکر شده اين پديده وجود دارد. کاهش کاذب ميزان آناليت ها خصوصاً در مورد شاخص هاي توموري مي تواند با تداخل در تشخيص، موجب تأخير در درمان و پيشرفت بيماري گردد، لذا مقابله با اين پديده امري حائز اهميت است. با طراحي دقيق سنجش ها مي توان غلظت شروع اين پديده را از غلظت هاي فيزيولوژيک و پاتولوژيک مورد نياز جهت سنجش دور نگاه داشت. اين مراحل به شرکت هاي سازنده کيت ها مربوط بوده، ذکر جزئيات آن از محدوده اين مختصر خارج است. اما توصيه مهم اين است که شرکت هاي سازنده موظف به ذکر محدوده شروع پديده هوک هستند، لذا براي رهايي از مشکلات مربوط به اين پديده بايد از کيت هايي استفاده شود که در آنها شروع پديده در غلظت هاي بالاي آناليت مشاهده مي شود
بخش علمی شرکت پادگین طب
(مرکز تحقیقات، مشاوره، تولید، واردات و تهیه کیت های تخصصی و فوق تخصصی پژوهش های پایه و بالینی)
این آدرس ایمیل توسط spambots حفاظت می شود. برای دیدن شما نیاز به جاوا اسکریپت دارید این آدرس ایمیل توسط spambots حفاظت می شود. برای دیدن شما نیاز به جاوا اسکریپت دارید
22872816- 22872815
